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¡Descarga Microbiologia y más Apuntes en PDF de Microbiología solo en Docsity! TEMA 5: TÉCNICAS DE OBSERVACION MICROSCÓPICA. El origen de la microbiología esta ligado a los microscopios. La función del microscopio es que la luz que relaje ale objeto que vemos entre con un determinado ángulo para poder verlo en el tamaño deseado.Los microscopios se pueden clasificar atendiendo al nº de lentes en simples y compuestos, y en función del principio en el que se basa la amplificación en MO (luz visible: campo claro, campo oscuro, contraste de fases, tridimensional, interferencia, fuerza atómica y confocal), ME (haces de e⁻: transmisión y barrido) y MU (luz ultravioleta: fluorescencia) Conceptos básicos de microscopia: Aumento: propiedad óptica s, aumenta el ángulo para que sea mayor de un grado, proporcionada por la lente objetivo y la lente ocular. contraste: se basa en Claridad o nitidez en las observaciones: no depende de las lentes sino de los métodos de tinción, de la longitud de onda y de los aumentos. Si esta no es buena por mucho que ampliemos la imagen, esta se seguirá viendose distorsionada en proporción al aumento que le apliquemos. Para mejorar esta debemos bajar la longitud de onda o aumentar el indice de refracción y así mejorar la claridad del microscopio. Contraste: solo se puede observar los objetos cuando nos encontramos el objetos en un medio diferente. Poder resolución: es la capacidad de distinguir dos puntos adyacentes como separados. Es longitud de onda entre 2AN (AN= índice de refracción (en el aire es 1) por el seno de un ángulo que forma). El valor numérico es inversamente proporcional a la claridad o nitidez del microscopio, es decir, cuanto menor sea el poder de resolución, mayor será la claridad. Nuestro sistema óptico no refleja realmente la realidad, debido a que el ojo ve las cosas con un ángulo de incidencia, si lo acercamos el mismo objeto lo vemos más grande ya que el ángulo de la entrada es mayor, es decir alfa es mayor, funciona así hasta un determinado punto debido a que tiene una limitación de 25cm donde no podemos enfocar bien el objeto, los microorganismos son invisibles debido al tamaño, el tamaño medio de un objeto que se pueden observar a 25 cm es de 1mm, los de menor tamaño no se pueden observar a simple vista, el ángulo que nos entra en el ojo algo invisible es con un grado de incidencia de menor de 1º. Las lentes de los microscopios provoca un aumento del ángulo de estrada. PREGUNTA: Se observa en un objeto con un semiángulo de 55º y un índice de refracción1,52º, con una luz verde azul de 500 nm ¿Sería posible observar un objeto de una micra? El poder resolución es de 200 nm, lo que equivale a 0,2 micras, por lo que si se podría ver un objeto de una micra incluso 5 veces más pequeño. Los diferentes tipos de microscopios se pueden clasificar según: La longitud de onda: Ópticos: hay varios tipos: microscopio de fondo claro, microscopio de fondo oscuro(no necesita tinciones), de contraste de fases (no necesita tener la muestra teñida, tiene un dispositivo llamado Zarnike que envía la luz de tal manera que detecta variaciones del índice difracción diminutas que distingue entre los rayos de sol que han atravesado algo y lo que no dando lugar a un contraste), luz ultravioleta(longitud de onda pequeña menor que el campo visible, hay dos tipos el normal (luz ultravioleta y otro de lentes de cuarzo, utilizando estas lentes con dispositivos para ver la luz ultravioleta ya que es muy potente, la muestra se ve en una pantalla que generan los rayos ultravioletas), fluorescencia ¿¿¿¿¿también usa la luz ultravioleta pero si se puede ver la imagen, la luz ultravioleta no se puede debido a que emite desde abajo sin por encima de muestra de forma oblicua pero no se veria nada pero por ello se tiene que teñir con florescencia como rrdamina.isotiscinato de florescencia que emite la luz visible????, microscopio de inmunofluorescencia que tiñen los anticuerpos. Tipos de microscopía óptica: • MO de campo claro: es el microscopio mas usado y esta compuesto por 2 series de lentes (objetivos y oculares) que funcionan conjuntamente para producir la imagen. Las muestras se visualizan al destacar sobre un fondo iluminado. El fondo es claro y la muestra a ver se contrasta mediante tinciones. Utiliza también aceite de inmersión para disminuir el PR. En la base hay una fuente de luz. En el brazo hay dos dispositivos giratorios para enfocar, de ajuste fino (micrométrico) y ajuste grueso (macrométrico), que pueden mover la platina o portaobjetos para enfocar la imagen. El condensador se monta dentro o por debajo de la platina, y enfoca un cono de luz sobre el portaobjetos. • MO de campo oscuro: la luz incide sobre la muestra solo desde los lados.Posee un diafragma y un condensador especiales.Se enfoca un cono hueco de luz sobre la muestra, de modo que solo la luz reflejada o refractada por la muestra interrumpiendo el paso de la luz puede formar una imagen.El fondo aparece negro, mientras que el objeto queda iluminado. Efecto tindal. Linea de luz entra en apagado y vemos particulas flotando, tipico polvo que flota. Si nos pusieramos en el rayo podriamos verlo, pero podemos ver su perperndicularidad y las particulas que hay en el.La resolución es muy alta.Permite el examen de los microorganismos sin teñir, observar su movilidad y ver estructuras internas de eucariotas. • MO de contraste de fases: permite visualizar células sin necesidad de tinción. Fondo brillante.Tiene un condensador con diafragma anular que produce un cono hueco de luz. Objetivo con anillo de fase en una placa cambiadora de fase. Las células poseen un n distinto al del medio y desvían los rayos de luz que las atraviesan. La luz que pasa a través de de una muestra sufre un retardo (imagen oscura sobre un fondo brillante). Permite observar montajes húmedos, detectar endosporas y cuerpos de inclusión y estudiar células eucariotas. • MO de interferencia diferencial: crea una imagen sobre la base de la detección de diferencias en los n y el espesor de la muestra. Unos prismas generan 2 ondas de luz polarizada plana en ángulo recto una respecto de la otra. Una de las ondas pasa a través de la muestra y la otra sirve de referencia y pasa por una zona clara. Tras atravesar la muestra las 2 ondas se combinan e interfieren entre sí, llegan desfasadas al ojo y forman una imagen tridimensional. Si no hay muestra los 2 haces llegan al mismo tiempo. Estructuras como paredes celulares, endosporas, gránulos, vacuolas y núcleo de eucariotas aparecen claramente visibles. • MO de fuerza atómica: se fundamenta en las interacciones atómicas de las partículas de la muestra que son captadas por un dispositivo situado muy cerca de la muestra (viva). Se trata de una sonda que se va moviendo sobre la muestra y recoge datos de las repulsiones atómicas (ondas desprendidas). Todo lo que detecta el dispositivo se transmite a través de un sistema informático y en una pantalla se muestran los resultados tridimensionales. Según el comportamientos químicos se pueden clasificar en: -Ácido : el auxocromo es un anión (carga neta negativa) como la eosina, roja congo o la fuscina. Se unen a estructuras con carga positiva. -Básico: el axocromo es un catión (carga neta positiva) como el azul de metileno,cristal violeta, safranina. Se unen a estructuras con carga negativa. -Neutros: son sales de colorantes ácidos y básicos que se combinan entre si. tinciones. Hay 3 tipos de tinciones: -Simple o directa: emplea solo un colorante y tiñen por igual toda la bacteria. -Negativas o indirectas: no es una verdadera tinción, se tiñe el medio y no la bacteria dando lugar a un contraste, como nigrosina que no entra dentro de la muestra, tiñe el medio de negro es similar a la microscopia de fondo oscuro. -Diferenciales: se emplee más de un colorante ,las células que se tiñen de manera diferente dependiendo del tipo de microorganismo. Hay dos tipos diferenciales más importantes: • GRAM: es el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de un método de tinción diferencial que divide a las bacterias en dos clases: Gram+ y Gram-. Se basa en la naturaleza de la pared celular. En el primer paso de esta tinción, el frotis se tiñe con cristal de violeta durante 2 minutos. Se tira el exceso y se aplica una solución yodoyodurada o Lugol- Yodo (actúa como mordiente; intensifica la tinción) durante 1 minuto, se tira el exceso y se decolora el frotis lavándolo con etanol o acetona. Este paso produce el aspecto diferencial de la tinción de Gram. Finalmente, el frotis se tiñe de nuevo con safranina, se aclara con H₂O y se seca. Al darle cristal de violeta (CV) se forman complejos de este tinte en el interior de las células. Luego el Lugol-Yodo hace que se fije más la unión del CV con la célula, formando un complejo llamado CV-I, que es más insoluble en H₂O y en alcohol. Las células se decoloran dependiendo de su porosidad. En unos casos se extrae CV-I y en otros no. La decoloración de contraste (safranina) se utiliza para células a las que se ha extraído CV-I. Gram posciticas de color morado y las gram negativas de color rosa. • TINCIÓN ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE: es otro método importante de tinción diferencial. Hay algunas bacterias difíciles de teñir, pero que una vez teñidas es difícil decolorarlas. Se trata de teñirlas con un tratamiento más fuerte: calentando una mezcla de fucsina básica y fenol (método de Ziehl-Neelsen). Una vez que la fucsina básica ha penetrado en la célula con la ayuda del calor y el fenol, las células ácido-alcohol resistentes no se decoloran fácilmente con una solución acidoalcohólica, permaneciendo de color rojo. Se diferencian 2 tipos de células: - Ziehl-Neelsen positivas: moradas, no se decoloran - Ziehl-Neelsen negativas: azules, se decoloran. Todas las ZN+ son Gram+, pero no todas las Gram+ son ZN+. -Específicas o selectivas: no tiñen toda la células, sino solo partes especificas: como con presencia de cápsulas, flagelos (el flagelo se engrosa mediante una tinción específica,el método utilizado es Leifsen) ,gránulos de volutina. o corpúsculo metacromático mediante tinción Wirtz. TEMA 6: LA CÉLULA PROCARIOTA I MEMBRANA PLASMÁTICA DE BACTERIAS Y ARQUEAS Esta formada por lípidos, proteínas periféricas e integrales, y carbohidratos. • Lípidos: son anfipaticos. Tienen un extremo polar hidrofilico (exterior) y un extremo no polar hidrofóbico, por dentro de la pared celular, imprescindible para las bacterias. • Proteínas periféricas e integrales: producen energía, transportan y sintetizan componentes. Las periféricas están débilmente unidas a la membrana. Son entre el 20 y el 30% del total. Las integrales son anfipaticas. Algunas atraviesan la bicapa. Son el resto. • Carbohidratos: están en la superficie esterna. Las membranas de procariotas carecen de esteroles, excepto las bacterias metanoforas y micoplasmas que sí los tienen. Los procariotas tienen hopanoides que sustituyen a los esteroles y tienen la misma función y se sintetizan a partir de los mismos precursores que los esteroles. Los eucariotas si poseen esteroles, que hacen que las membranas sean mas estables (rigidas), pero menos flexibles. Bacterias: tiene entre 5 y 10 nm de grosor, por lo que es visible a ME. Es un sistema de membrana unitaria que se extiende por dentro de la pared celular, imprescindible para las bacterias. Arqueas: la membrana es distinta. La naturaleza de los lípidos es distinta a la de bacterias y eucariotas. Presentan hidrocarburos de tipo isoprenoide de cadena ramificada unidos a glicerol por enlace éter, dando isoprenil glicerol. Pueden formarse dieteres y tetraeteres de glicerol. Los lípidos con enlace éter indicativo tienen origen y prevalencia en medios extremos. Funciones: • retiene el citoplasma y lo separa del exterior. • actúa como barrera selectivamente permeable, evita la pérdida de componentes esenciales y permite el transporte de moléculas (permite pasar iones y algunas moléculas). • en ella se desarrollan numerosos procesos metabólicos de generación y de gasto de energía. • relaciona la célula con el exterior mediante receptores. • barrera de permeabilidad: evita pérdidas y funciona como puerta de entrada y salida de nutrientes. • anclaje de proteínas: situación de muchas proteínas implicadas en el transporte, bioenergética y quimiotaxis. • conservación de energía: lugar donde se genera y usa la fuerza motriz de H⁺. FUNCIONES, COMPOSICION Y ESTRUCTURA DE LA PARED CELULAR Es una estructura compleja que recubre la membrana citoplasmática. No se observa fácilmente a MO, pero si a ME. Funciones: • responsable de la morfología característica de la célula. • protege y mantiene la integridad celular frente a la lisis osmótica, debido fundamentalmente al peptidoglicano (PG). • en muchos patógenos tiene componentes que contribuyen a su patogenicidad. • protege a la célula frente a sustancias tóxicas y es lugar de acción de varios antibióticos. • punto de anclaje para los flagelos. *la penicilina inhibe la transpeptidizacion. Produce la lisis de la pared celular e impide la síntesis de la misma. La pared protege frente a la penicilina. La mayoría de las bacterias poseen pared celular. La penicilina rompe las interacciones en periodo de crecimiento o lo que ya esta formado???? Composición y estructura: el PG (macromolécula asociada a la pared celular) tiene una distribución prácticamente universal salvo excepciones como la de las arqueas, y la de los micoplasmas, que no tienen pared, y algunas otras bacterias (pocas) que tienen pared pero sin PG (Planctomyces, Pasteuria). Las bacterias Gram+ tienen entre 20 y 80nm de PG unido a la membrana plasmática. Las bacterias Gram- tienen entre 2 y 7nm de PG, junto con la membrana plasmática, otra membrana, y el espacio periplásmico. Espacio periplásmico: espacio entre la membrana plasmática y la membrana externa de las Gram-. En Gram+ se puede observar un espacio similar pero más pequeño entre la membrana plasmática y la pared celular. Este espacio está ocupado por PG muy hidratado, con consistencia gelatinosa, y con abundantes proteínas. Estructura del peptidoglucano (PG): el PG o mureína es un gran polímero compuesto por muchas subunidades idénticas. Está formado por polímeros de azúcares y aa's. El PG esun heteropolimero que contiene 2 derivados de azúcar: el N-acetilglucosamina (NAG) y el acido N-acetilmuramico (NAM), derivado del NAG. Estos dos compuestos forman el glucano y son el eje del PG que junto con la cadena lateral de aa’s forman el PG. NAG + ac. Láctico NAM: forma un enlace peptídico en el C3 con el acido láctico. El grupo COOH del NAM es muy reactivo y puede formar enlaces con aa’s, que en procariotas puden ser del tipo D y L. El esqueleto de este polímero esta constituido por residuos alternantes de NAG y NAM. Se alternan por enlaces beta 1->4 (enlaces glucosidicos muy fuertes). Esta formado por 4 aa: L-alanina, D-glutamico, ac. Meso-diaminopimelico y D-alanina L-alanina D-glutamico Ác. meso-diaminopimélico -> es una mezcla entre D y L, puede variar con la lisina u otro aa. Permite enlaces intracatenarios con otros tetrapeptidos o intercatenarios entre moléculas de PG. D-ala (tiene un COOH terminal que puede unirse a otra cadena tetrapeptídica por un puente peptídico, o directamente al ácido diaminopimélico de la otra cadena). En presencia de lisocima se rompen los enlaces de los 4 aa. Las cadenas de subunidades de PG están entrecruzadas por sus péptidos. A menudo, el grupo carboxilo de la D-ala terminal de una mureína está conectado directamente al grupo amino del ácido diaminopimélico de una mureína de otra cadena paralela, pero en otras ocasiones se puede emplear en su lugar un interpuente peptídico. Hay una gran variedad de PG. Hay más de 100 quimiotipos.