¡Descarga tecnologia del and y más Apuntes en PDF de Veterinaria solo en Docsity! jueves, 15 de octubre de 2015 GENÉTICA MOLECULAR TECNOLOGIA DEL ADN(I) REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PCR es una técnica altamente específica. DR. KARY MULLIS, este señor sintetizaba en el laboratorio pequeñas cadenas de ARN. Se dio cuenta de que necesitaba copiar ADN. Hay enzimas que van separando el ADN, pero en el laboratorio con el calor ya puedes separarlo para leerlo. Enzimas polimerasas copiaban, la enzima primasa, sintetizaba un cebador o primer, pequeña cadena de ADN unicatenario que se unía a la hebra que tenia que ser copiada y de ahí empezaba a copiar. La polimerasa la sacaba de bacterias. Ya tenia todo lo necesario para hacer una copia de ADN. Mete ADN que quiere duplicar, nucleónidos, polimerasas y cebadores. Caliento molécula de AND que quiero duplicar, hasta los 98º grados y el ADN se desnaturaliza. Dentro del tubo están los cebadores, ahora enfrio a 50-60º, así se unen los cebadores. Siguiente fase, caliento hasta los 72º aproximadamente y la polimerasa hace la copia, que también esta dentro del tubo. Ahora tengo dos cadenas, pero puedo tener más si repito el proceso. De dos tengo 4, de 4 tendré 8… A partir de esta copia del ciclo con el PRC (dos o tres minutos por ciclo) se vuelve a desnaturalizar. Con este proceso obtendremos millones de copias. Para poner apunto a la PCR el cebador es lo que le da especificidad. Para diagnosticar un tipo de cáncer necesito saber la secuencia exacta de la secuencia de ese gen. Y por ellos tengo que diseñar unos primer. PCR lo que hace es amplificar el ADN, porque necesito bastante cantidad de ADN. Para visualizar el ADN se hace mediante la técnica de fluorescencia. Una PRC en veterinaria, por ejemplo para lesihmania, haces primers específicos para detertarla. La leishmania se acantona en vísceras, por ello debemos hacer una punción ganglional, se extrae liquido linfático. PCR: Es una copiadora de ADN. Especificidad: la dan los cebadores. Las mutaciones en el ADN se dan con frecuencia, pero casi todas son silenciosas, no tienen efectos, pero hay alguna que no. - Enzimas de restricción: cortan el ADN en puntos específicos. - Con la PCR también se puede detectar parásitos en sangre. Por ejemplo para Leishmania. - Retrotranscripción seguida de PCR: RT-PCR —> para detectar ARN. Traducimos ADN a partir de ARN y a partir de ahi ya tengo la PCR. En esta técnica utilizaré en la RT utilizo solo un primer porque es monocatenario el ARN y en la PCR utilizo dos. - Para el ADN amplifico una parte. - Amplicón: te indica inicio y fin. - A partir del tercer ciclo ya tengo el fragmento de ADN acotado, el que quiero. - El numero de copias conforme pasan los ciclos aumentan de forma exponencial. - Los primers: - Conocemos su secuencia - Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del proceso - Deben estar presentes en exceso, para que encuentren a su molde dentro del tubo, el gadget. - Requieren de un cuidadoso diseño - Reglas de diseño: • Longitud de 18-25 pb para que sean especificos 1
