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TINCIONES HEMATOLÓGICAS CONTENIDOS 1. Concepto 2. Tipos de tinciones: 2.1. 2.2. Tinciones vitales y no vitales tinciones habituales y especiales 3. Denominación de las estructuras coloreadas 4. Causas de error en las tinciones habituales de frotis sanguíneos Práctica n° VIII: Tinción de Giemsa Práctica n° IX: Tinción de Wright Práctica n° X: Tinción panóptico rápida. 1. CONCEPTO Las tinciones hematológicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las estructuras que componen las células sanguíneas. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las células sean visualizadas microscópicamente con mayor facilidad. 2. TIPOS DE TINCIONES Las tinciones hematológicas pueden clasificarse según distintos criterios: · Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretenden colorear, se dividen en tinciones vitales y no vitales. · Atendiendo a su frecuencia de realización en el diagnostico hematológico cotidiano, se dividen en tinciones habituales y especiales. 2.1. Tinciones vitales y no vitales Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre células que están vivas. Son colorantes vitales, por ejemplo, las sales de tetrazolio y el verde Jano. Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el conservar inalterada la estructura de las células y el adherir a éstas firmemente a la superficie del porta. La fijación puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol. 2.2. Tinciones habituales y especiales Las tinciones habituales se logran generalmente mediante el uso de colorantes derivados de la anilina. Estos se reúnen en 3 grupos. · Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad con las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina. · Colorantes básicos: tienen una especial afinidad con las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno. · Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de metileno. · Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad con estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tiene un poder de disolución superior al del líquido empleado para prepara la solución colorante. Uno de ellos es el Sudán III empleado para teñir las grasas. También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones policromas. Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrómica se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas. El primer que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematológicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que él preparó. Los colorantes de tipo Romanowsky, que más frecuentemente se emplean, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinación con la de May-Grunwald). También hay tinciones panóptica rápidas que producen una coloracion fácil y rápida de las estructuras celulares. Las tinciones especiales sólo se usan en circunstancias especificas. Son de dos clases. · Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las células y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiación visible, de un color característico. Los fluorocromos más utilizados en esta clase de tinciones con el naranja de acridina y el rojo neutro. · Tinciones citoquímicas: demuestran la presencia, más o menos abundante, o la ausencia de determinadas sustancias, localizadas en el interior de los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos. Sirven para reconocer células leucocitarias (normales o anómalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia de peroxidas endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de unas células leucocitarias inmaduras a la línea granulocítica o a la monolítica. 3. DENOMINACION DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS Atendiendo a sus apetencias tintoriales, las estructuras celulares pueden nombrarse de las siguientes formas: · Estructuras acidófilas u oxífilas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza ácida. Si el colorante ácido que captan es la eosina, se dice que son eosinófilas. Con las tinciones habituales adquieren un color rosado. · Estructuras basófilas; son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina. Con las tinciones habituales adquiern un color azulado. Si se tiñen de lila o púrpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurófilas. 4. CAUSAS DE ERROR EN LAS TINCIONES HABITUALES DE FRONTIS SANGUINEOS Si la tinción de una extensión sanguínea es demasiado rosa, probablemente se deba a: · · · Un pH bajo del colorante. Un tiempo de coloración insuficiente. Un lavado excesivamente prolongado. Si la tinción es demasiado azul, posiblemente, esté causado por: · · · · Un grosor excesivo de la extensión. Un pH alto del colorante. Una coloración excesivamente prolongada. Un lavado insuficiente. Si tras la tinción, aparecen artefactos o/y precipitados en la extensión, probablemente, se deba a: · Un empleo de portas sucios. · · · · Una falta de filtración del colorante. Una coloración excesivamente prolongada Un secado del colorante durante la tinción. Un lavado insuficiente. Muchos de estos errores pueden obviarse utilizando teñidores automáticos de las extensiones sanguíneas. Uno de estos teñidores automáticos es. Por ejemplo, el Hematek de los laboratorios Bayer. TINCIÓN DE GIEMSA INTRODUCCIÓN Las tinciones hematológicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus productos de oxidación (azur A, Azur B y azur C) como colorantes básicos, combinándolos con la eosína como colorante ácido. De este modo obtenemos una tinción diferencial, es decir, que es capaz de diferenciar distintas estructuras celulares según se tiñan con el colorante ácido, básico o con la mezcla de ambos. Según la proporción de azul de metileno y eosina que compongan el colorante tendremos distintos métodos de tinción. Entre ello, los más conocidos son el método de Gemsa, de Wright, de Leishman y el panóptico de Pappenheim. METÓDICA Es un extracto de las técnicas de tinción hematológicas de la casa Panreac. Fundamento Utilizamos como colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por Giemsa. Material necesario · · · · · · · Reactivos · · · · Muestra Microscopio óptico Portas bien limpios Cristalizador Puentes de tinción Pipetas Pasteur con chupete Frascos lavadores Tubos de ensayo Colorantes en solución según Giemsa de Panreac Solución tampón pH 7,2 de Panreac Metanol Aceite de inmersión. Sangre capilar fresca o vanosa anticoagulada. El anticoagulante de elección es la heparina o el EDTA, ya que el citrato sódico y el oxalato potásico pueden dar preparaciones defectuosas. Técnica Preparamos una frotis sanguíneo según la técnica descrita e la práctica n° VII. Colocamos el frotis sobre el puente de tinción en el cristalizador en posición horizontal. Cubrimos con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y dejamos secar al aire. Con esto procedemos a fijar el frotis. Diluimos en el tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno según Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7,2. es importante realizar esta dilución en el momento de la tinción, ya que el colorante precipita y no es válido para otro día. Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frontis dejando actuar durante 25 minutos. Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampón pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posición vertical (véase figura 4.VIII.1) Lectura de resultados Una vez seca la tinción, echamos una gota de aceite de inmersión y examinamos al microscopio óptico con el objetivo de 100x. Los eritrocitos se tiñen de color rosa asalmonado y las plaquetas de color violeta. Los neutrófilos presentan el núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación de un color violeta rojizo. Figura 4.VIII.1. Tinción de Giemsa Los eosinófilos se observan con el núcleo azul violeta, el citoplasma azul y los gránulos de color rojo anaranjado. Los basófilos presentan un núcleo de color púrpura y granulación de color azul oscuro. Los monolitos y linfocitos se observan con un núcleo color violeta y el citoplasma azul, un poco más claro en el monolito. 1° ¿Cuáles son los anticoagulantes más adecuados para esta técnica? 2° ¿Con qué reactivo fijamos el frotis? 3° ¿Cuánto tiempo debe actuar el colorante en el frontis? Resultados obtenidos Dibuje las células observadas con colores semejantes a los que ha visto en el microscopio. TINCIÓN DE WRIGHT METÓDICA Extracto de las técnicas de tinción hematológicas de las casa Panreac. Fundamento El colorante utilizado es una solución de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azur B (del 10ª 25%) junto con otros derivados del alcohol metílico. Dada la presencia de metanol en la composición del colorante, no es necesario un paso previo de fijación antes de la coloración. Sólo si se van a guardar las extensiones sin teñir de un día para otro precederemos a su fijación para evitar el deterioro del frotis. Material necesario · · · · · · · Reactivos Microscopio óptico Cristalizador Puentes de tinción Pipetas Pasteur con chupete. Frasco lavador Guantes Tubos de ensayo. · · · Muestra So

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