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Laboratorio de Analitica 8

Quimica Analitica - Quimica UMA

Profesor: Quimica Analitica

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Curso de Química Analítica 2004 Licenciatura en Bioquímica Unidad de Bioquímica Analítica CIN ­ Facultad de Ciencias LABORATORIO Nº 8 Identificación de aminoácidos en una muestra problema por cromatografía en capa fina Es obligatorio la asistencia al práctico con túnica y lentes de seguridad. El protocolo de la práctica y el fundamento teórico de la misma deben haber sido leídos por el estudiante antes del ingreso al práctico. Al práctico se debe asistir con un cuaderno donde figurarán todos los datos y cálculos realizados en el curso práctico. Dicho cuaderno puede ser solicitado al alumno en cualquier momento a fin de corregir el trabajo realizado durante el curso FUNDAMENTO TEÓRICO La cromatografía en capa fina (CCF o TLC) no constituye un buen sistema para la realización de separaciones analíticas cuantitativas, pero sí un sistema rápido, económico y confiable para determinar las condiciones óptimas para una cromatografía separativa, así como para evaluar el avance de reacciones en procesos de síntesis o estudios físico-químicos. Por lo general, las CCF constituyen un ejemplo de cromatografía de adsorción, en la cual la fase estacionaria sólida (alúmina o sílica gel) se deposita sobre una superficie lisa para formar una capa fina lo más homogénea posible. En las primeras CCF se utilizaba como soporte el vidrio que luego fue sustituido parcialmente por finas láminas de aluminio. En la actualidad está muy difundido el uso de materiales plásticos como soporte, debido principalmente a su bajo costo y a la comodidad de trabajo con materiales flexibles de fácil adaptación a las condiciones de laboratorio. Una pequeña alícuota de la(s) muestra(s) a analizar (1-2 µL), se "siembra" con un capilar de vidrio, una aguja o una pipeta, a una distancia del borde inferior de la placa de 1 a 2 cm y se espera a que se seque, generalmente a temperatura ambiente. La placa así preparada se coloca verticalmente en una cámara cerrada, preferiblemente de vidrio, que contiene previamente el disolvente o mezcla de disolventes que constituye(n) la fase móvil. Es importante preparar la cámara cromatográfica con alguna antelación cuidando que quede hermética, de forma de permitir la saturación de la atmósfera interior con el disolvente de la fase móvil. La importancia de este proceso radica en la necesidad de evitar posibles pérdidas de la muestra, sobre todo si la misma es una especie volátil, debido al establecimiento de un equilibrio de reparto entre la fase móvil y el aire contenido en la cámara. Otra fuente posible de pérdidas innecesarias de la muestra se debe a que la misma pueda disolverse en la fase móvil contenida en la cámara cromatográfica. Para evitar este 1 Laboratorio 8 Identificación de aminoácidos en una muestra problema por cromatografía en capa fina Curso de Química Analítica 2004 Licenciatura en Bioquímica Unidad de Bioquímica Analítica CIN ­ Facultad de Ciencias fenómeno es fundamental que el "punto de aplicación" (lugar donde fue sembrada la muestra) quede siempre por encima del nivel del disolvente en la cámara. Una vez colocada la placa en la cámara cromatográfica, la fase móvil comenzará a ascender por la misma disolviendo y desplazando la muestra desde el punto de aplicación en función de la mayor o menor afinidad por una u otra fase de cada uno de los componentes contenidos en la muestra. Al nivel del disolvente en la placa se le suele llamar "frente del disolvente". Una vez alcanzada la altura deseada del frente del disolvente, se retira la cromatografía de la cámara y se permite su secado. Cuando las condiciones y características de la muestra lo permiten, este proceso puede acelerarse exponiendo la placa a una corriente de aire cálido. Cuando la placa está seca, se procede a su "revelado", o sea se busca identificar el lugar en que quedaron los distintos componentes de la muestra original. Para estos fines existen distintos procedimientos como el uso de un revelador específico cuando el mismo está disponible (tal es el caso de la ninhidrina), el uso de reveladores inespecíficos (como la atmósfera de I2), o la exposición de la placa a la luz UV. En algunas placas, el revelador se encuentra previamente incorporado a la fase estacionaria. El parámetro que finalmente permite identificar a los distintos componentes de la mezcla que se analiza es el Rf. Éste se define como la relación entre la distancia recorrida (en cm) por una especie química a lo largo de la fase estacionaria, y la distancia recorrida por el frente del disolvente. Frente de disolvente y x Rf = x y Línea de base o punto de aplicación El Rf dependerá directamente de la afinidad de la especie en cuestión por cada una de las fases y será característica de cada especie química siempre que se use igual sistema cromatográfico, entendiendo por esto último el sistema compuesto por el soporte, la fase estacionaria y la fase móvil. Es necesario cuidar durante la "corrida" aspectos secundarios que son de importancia como el hecho de que la cámara cromatográfica se encuentre sobre una superficie nivelada y que la fase estacionaria no entre en contacto con las paredes de la misma pues estos factores pueden alterar el resultado. 2 Laboratorio 8 Identificación de aminoácidos en una muestra problema por cromatografía en capa fina Curso de Química Analítica 2004 Licenciatura en Bioquímica Unidad de Bioquímica Analítica CIN ­ Facultad de Ciencias Las "manchas" que al ser reveladas producen las diferentes especies no suelen ser de igual tamaño por lo que para el cálculo de los Rfs correspondientes suele medirse desde o hasta el centro de las mismas. Cuando la muestra a analizar constituye una mezcla de varios analitos entre los cuales algunos presentan Rf muy cercanos en determinados disolventes, suele realizarse una cromatografía bidimensional, que consiste en, una vez seca la placa y luego de girarla 90°, colocarla en otra cámara cromatográfica que contiene otra fase móvil diferente, lo que permite mejorar la separación de los diferentes componentes. Es imposible abarcar en una introducción a un protocolo de clases prácticas todo un tema sobre el que se han escrito voluminosas monografías, por lo que se recomienda al estudiante profundizar en bibliografía especializada. PROTOCOLO EXPERIMENTAL En esta práctica se procederá a separar diferentes componentes de una muestra problema por medio de una cromatografía de capa fina (TLC). Se dispondrá en el laboratorio de tres muestras patrón de aminoácido, y una muestra problema que contiene una mezcla de estos aminoácidos. Las muestras se siembran con un capilar sobre una placa de sílica gel (fase estacionaria) la cual debe manipularse con guantes. Realizar una línea de base a 1.5 cm del borde inferior de la placa y marcar sobre esta línea los puntos a sembrar (tres patrón y una muestra problema). Dejar secar las muestras sembradas y luego colocarlas en un recipiente que contenga como fase móvil una mezcla de butanol : ácido acético : agua (80 : 20 : 20). Una vez finalizada la corrida sacar la placa con cuidado y dejar secar. Rociar la placa seca con NINHIDRINA 0.3 % en etanol : ácido acético (50 : 50). La ninhidrina se utiliza como revelador para visualizar la corrida de las muestras. Determinar los Rf respectivos e identificar los aminoácidos de la muestra problema. 3 Laboratorio 8 Identificación de aminoácidos en una muestra problema por cromatografía en capa fina

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